1. Cellyse en eiwitdenaturatie
In de beginfase van de plasmide-DNA-extractie moeten cellen worden gelyseerd om het DNA binnenin vrij te maken. Dit proces wordt meestal bereikt door gebruik te maken van hoge concentraties zouten, detergentia of enzymen. In dit proces is de belangrijkste rol van Tris het stabiel houden van de pH van de oplossing, waardoor het DNA wordt beschermd tegen de zure omgeving die wordt gegenereerd tijdens het lyseproces. Daarnaast kan Tris ook helpen DNA uit lysaten te isoleren door eiwitten te binden en te denatureren.
2. DNA-solubilisatie en stabilisatie
Na cellyse moet plasmide-DNA worden gelyseerd en geïsoleerd van andere cellulaire componenten. Dit proces wordt meestal bereikt door een hoge concentratie zout of wasmiddel te gebruiken. In dit proces is de belangrijkste rol van Tris het verschaffen van een geschikte ionsterkte en pH-omgeving om de oplosbaarheid en stabilisatie van DNA te bevorderen. De hydroxyl- en aminogroepen van Tris kunnen waterstof- en ionische bindingen vormen met DNA-moleculen, die de structuur ervan stabiliseren en de afbraak ervan voorkomen. Bovendien kan Tris DNA verder beschermen tegen afbraak door de activiteit van nucleasen te remmen.
3. DNA-zuivering en -herstel
Nadat het plasmide-DNA uit het lysaat is geïsoleerd, is vaak een reeks zuiveringsstappen vereist om resterende eiwitten, RNA en andere onzuiverheden te verwijderen. Deze stappen omvatten fenol/chloroform-extractie, ethanolprecipitatie, enz. In dit proces is de belangrijkste rol van Tris het stabiel houden van de pH van de oplossing, waardoor het DNA wordt beschermd tegen de zure of alkalische omgeving die tijdens de zuivering kan ontstaan. Bovendien kan Tris ook helpen puur plasmide-DNA uit de oplossing terug te winnen door zich aan onzuiverheden te binden en deze te laten neerslaan.
